Clara® Probe 1-Step Mix

Các giá trị Ct có thể biến đổi tùy thuộc vào nồng độ mẫu, tối ưu hóa phản ứng, thiết bị và phòng thí nghiệm, vì vậy cần thận trọng khi chọn giá trị Ct cắt. Thông thường, các giá trị Ct trên 35-40 sẽ được cho là không đáng tin cậy. Tuy nhiên, các Ct muộn có thể được quan sát thấy đối với các phản ứng không hiệu quả sử dụng số lượng bản sao mẫu thấp. Luôn là thực tiễn tốt khi chuẩn hóa các giá trị cắt với các phương pháp định lượng tương đối hoặc tuyệt đối. Cũng nên khuyến nghị chạy và phân tích đường cong nhiệt hoặc gel của sản phẩm để xác định các sản phẩm từ bất kỳ sự khuếch đại muộn nào.

Có. Clara® Probe 1-Step Mix có thể khuếch đại các mục tiêu cDNA và RNA một cách đồng đều. Tuy nhiên, vì hỗn hợp này chứa RTase, nên nó lý tưởng cho các quy trình 1 bước. Chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng Clara® Probe 1-Step Mix cho các quy trình 1 bước và khi các thí nghiệm cần phát hiện DNA trong một số mẫu hạn chế, và sử dụng Clara® Probe Mix cho các giao thức 2 bước và phát hiện DNA định kỳ.

Có, các sản phẩm PCR được tạo ra với các hỗn hợp này có cùng đặc điểm như các sản phẩm PCR được tạo ra với Taq polymerase loại hoang dã. Chúng có thể được giải trình tự hoặc tiêu hóa bằng các enzyme giới hạn sử dụng các giao thức chuẩn. Sản phẩm có đầu 3′-d(A) và có thể được sử dụng cho nhân bản TA hoặc có thể được cắt hoặc tiêu hóa bằng các enzyme giới hạn trước khi nhân bản. Để đạt kết quả tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên tinh chế các sản phẩm PCR bằng bất kỳ bộ tinh sạch PCR nào tiêu chuẩn.

ROX (6-carboxy-X-rhodamine) được sử dụng như một thuốc nhuộm tham chiếu thụ động trong các thiết bị PCR thời gian thực phụ thuộc ROX để chuẩn hóa cho sự biến đổi của mức độ phát quang có thể xảy ra chủ yếu do sự thay đổi quang học giữa các giếng. Việc chuẩn hóa cường độ phát quang (Rn) được thực hiện trong phần mềm PCR thời gian thực bằng cách chia cường độ phát xạ của tín hiệu cụ thể cho cường độ phát xạ của ROX.

ROX không tham gia vào phản ứng PCR và mức độ phát quang của nó không tỷ lệ với lượng DNA trong mỗi giếng, vì vậy việc thêm fluorophore này vào hỗn hợp cung cấp một tín hiệu phát quang không đổi trong suốt quá trình khuếch đại.

Các loại thiết bị PCR thời gian thực khác nhau yêu cầu một tiêu chuẩn tham chiếu thụ động có nồng độ ROX tối ưu khác nhau, chủ yếu do các cấu hình quang học khác nhau của mỗi hệ thống (tức là loại nguồn kích thích và quang học khác nhau được sử dụng).

Việc thêm quá ít hoặc quá nhiều ROX sẽ dẫn đến một tín hiệu rất ồn sẽ ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng. Do đó, rất quan trọng cho người dùng:

1. Xác định nồng độ ROX đúng để tối ưu hóa kết quả PCR thời gian thực, và
2. Kiểm tra cài đặt ROX trên phần mềm được sử dụng để thiết lập phản ứng

Một công cụ lựa chọn hữu ích cho các hệ thống thường được sử dụng có thể được tìm thấy tại đây.

Không. Ngoài ROX (nếu có trong bộ), không có thuốc nhuộm nào khác trong các hỗn hợp của chúng tôi. Do đó, bạn có thể sử dụng bất kỳ probe gắn fluorophore nào cho phản ứng của bạn.

Không, hỗn hợp này chứa chất ức chế RNase để ngăn ngừa bất kỳ sự phân hủy nào và tăng cường độ nhạy.

Các sản phẩm khác nhau có thể tạo ra mức độ phát quang khác nhau. Tuy nhiên, điều này không ảnh hưởng đến độ chính xác của định lượng và các giá trị Ct sẽ không khác nhau giữa các sản phẩm.

Có, đệm bảo quản này là tương thích. EDTA sẽ chelat một số magnesium trong hỗn hợp, nhưng không đủ để ảnh hưởng đến phản ứng.

Các hỗn hợp Clara® Probe Purple và Clara® Probe 1-Step Purple chứa các thuốc nhuộm tham chiếu thụ động đi kèm với các công thức khác nhau, mỗi loại có nồng độ thuốc nhuộm tham chiếu thụ động khác nhau:

Các hỗn hợp Lo-ROX (PB20.65 và PB25.85) có chứa 200 nM ROX.
Các hỗn hợp Hi-ROX (PB20.66 và PB25.86) có chứa 2 µM ROX.
Các hỗn hợp No-ROX (PB20.67 và PB25.87) không chứa ROX.

Các hỗn hợp Separate-ROX (PB20.68 và PB25.88) bao gồm một ống riêng của phụ gia ROX 50 µM. Điều này cho phép bạn chọn nồng độ ROX mà bạn muốn sử dụng.
Bạn có thể sử dụng Công cụ Lựa chọn qPCR của chúng tôi trong menu drop-down Tài nguyên để xác định loại hỗn hợp nào của chúng tôi phù hợp nhất với máy qPCR của bạn.

ROX là một thuốc nhuộm tham chiếu thụ động có nghĩa là nó không tham gia vào phản ứng PCR. Nó được sử dụng để chuẩn hóa cho các biến động không liên quan đến PCR trong sự phát quang. Bạn có thể sử dụng Công cụ Lựa chọn qPCR của chúng tôi trong phần Tài nguyên để xác định loại hỗn hợp qPCR nào phù hợp nhất với máy qPCR của bạn.

Nếu có hiện tượng ức chế được quan sát, có thể giảm lượng mẫu trong phản ứng. Điều này sẽ làm tăng giá trị Ct nhưng giảm khả năng các chất ức chế can thiệp vào hoạt động của Taq DNA polymerase. Nếu điều này không hiệu quả, hãy thử thêm 0.4-4 mg/ml BSA vào phản ứng^1,2. Đảm bảo rằng các điều kiện chu kỳ trong hướng dẫn sản phẩm của chúng tôi được tuân thủ.

1. Kreader, C. A. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. Appl Environ Microbiol 62, 1102-1106 (1996).
2. Wilson, I. G. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Appl Environ Microbiol 63, 3741-3751 (1997).

Có báo cáo rằng hiệu suất có thể giảm với các pha loãng tiếp theo cho đường chuẩn. Chúng tôi khuyên bạn nên tránh điều này bằng cách pha loãng các tiêu chuẩn trong 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 0.05% Tween-20. EDTA là một tác nhân chelat và có vai trò trong việc ngăn chặn hoạt động của DNAse¹. Tween-20 là một chất tẩy rửa và ngăn ngừa DNA bám vào thành của các ống². Hầu hết các máy ly tâm vi mô được làm từ polypropylene và nghiên cứu đã chứng minh rằng DNA bám rất tốt vào polypropylene³.

Các tiêu chuẩn không nên được đông lạnh sau khi pha loãng. Ngay cả trong sự hiện diện của chất tẩy rửa, việc đông lạnh dường như khiến DNA bám vô hiệu vào polypropylene. Chúng tôi gợi ý để các tiêu chuẩn của bạn ở 4°C và chuẩn bị một mẻ mới sau vài tuần.

1. Barra, G. B. et al. EDTA-mediated inhibition of DNases protects circulating cell-free DNA from ex vivo degradation in blood samples. Clin Biochem 48, 976-981, doi:10.1016/j.clinbiochem.2015.02.014 (2015).
2. Linnarsson, S. Recent advances in DNA sequencing methods – general principles of sample preparation. Exp Cell Res 316, 1339-1343, doi:10.1016/j.yexcr.2010.02.036 (2010).
3. Gaillard, C. & Strauss, F. Avoiding adsorption of DNA to polypropylene tubes and denaturation of short DNA fragments. Technical Tips Online 3, 3 (1998).

Có nhiều lựa chọn để xem xét khi tối ưu hóa phản ứng:

• Giảm thời gian tạo cầu / kéo dài xuống 5 giây
• Tăng nhiệt độ tạo cầu / kéo dài từ 60 lên 65°C

Pha loãng mẫu DNA bằng cách bắt đầu với 5ng DNA và sử dụng một chuỗi pha loãng mẫu 10x. Ngoài việc chạy những điều này trên gel để xem nếu các sản phẩm không cụ thể vẫn tồn tại, hiệu suất của phản ứng có thể được tính toán với phần mềm của thiết bị qPCR sau khi thực hiện pha loãng mẫu. Nếu hiệu suất nằm trong khoảng 90 – 110%, thì amplicon đang được gấp đôi mỗi chu kỳ.

Các giá trị Ct cao hơn thường chỉ ra việc khuếch đại bị trì hoãn. Điều này có khả năng là do dư thừa mẫu trong phản ứng dẫn đến việc các primer và probe bị ràng buộc trên các phân tử DNA khác nhau. Mẫu thường có rất nhiều DNA không phải gen mục tiêu và điều này có thể làm phân tán các oligos. Chúng tôi khuyên bạn nên pha loãng các mẫu (10x-1000x) để giải quyết điều này.

Hơn nữa, nhiệt độ tạo cầu / kéo dài cũng có thể được tăng lên để làm cho việc gắn kết của các oligos trở nên cụ thể hơn với trình tự mục tiêu và giảm thiểu tín hiệu nền.

Chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng 0.4 µM cho mỗi primer. Có một mức độ linh hoạt xung quanh nồng độ khuyến nghị này, tuy nhiên, nồng độ primer không nên được tăng lên, vì điều này có thể ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động của enzyme.

Để biết thêm thông tin về multiplexing, xin tham khảo Hướng dẫn Kỹ thuật qPCR của chúng tôi.

Điều này có khả năng xảy ra vì thời gian cho bước đầu tiên (bắt đầu nóng) quá ngắn. Đảm bảo rằng giai đoạn bắt đầu nóng được thực hiện ở 95°C trong 2 phút để kích hoạt hoàn toàn enzyme. Hồ sơ nhiệt độ được khuyến nghị là:

• 95°C (120 giây)
• 40 chu kỳ: 95°C (5-15 giây) – 60°C (20-30 giây)
• Nấu chảy

Nếu vẫn thu được các sản phẩm không cụ thể, chúng tôi khuyên bạn nên tăng nhiệt độ tạo cầu / kéo dài từ 60°C lên 65°C, tùy thuộc vào bộ primer được sử dụng.

Có, Clara® Probe 1-Step Mix có thể được sử dụng cho các mẫu micro RNA. Mặc dù chúng tôi không bán các bộ kit chuyên dụng, tất cả các RTase của chúng tôi có thể được sử dụng cho việc định lượng và phân tích miRNA.

Chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng một trong hai phương pháp sau:

• Sử dụng các primer RT phổ quát và thêm đuôi poly(A) hoặc poly(U) (ví dụ: bằng enzym polymerase poly(U)), tiếp theo là tổng hợp cDNA bằng các primer phổ quát1,2.
• Sử dụng các primer RT cụ thể và bỏ qua bước thêm đuôi 1, 3-5.

Nếu bạn không quen với các phương pháp này, vui lòng tham khảo danh sách tài liệu dưới đây, sẽ được coi là hướng dẫn.

1. Dave, V. P. et al. MicroRNA amplification and detection technologies: opportunities and challenges for point of care diagnostics. Lab Invest 99, 452-469, doi:10.1038/s41374-018-0143-3 (2019).
2. Mei, Q. et al. A facile and specific assay for quantifying microRNA by an optimized RT-qPCR approach. PLoS One 7, e46890, doi:10.1371/journal.pone.0046890 (2012).
3. Chen, C. et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res 33, e179, doi:10.1093/nar/gni178 (2005).
4. Raymond, C. K., Roberts, B. S., Garrett-Engele, P., Lim, L. P. & Johnson, J. M. Simple, quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA 11, 1737-1744, doi:10.1261/rna.2148705 (2005).
5. Androvic, P., Valihrach, L., Elling, J., Sjoback, R. & Kubista, M. Two-tailed RT-qPCR: a novel method for highly accurate miRNA quantification. Nucleic Acids Res 45, e144, doi:10.1093/nar/gkx588 (2017).