PCRBIO Classic Taq

Bộ đệm phản ứng PCRBIO 10x đi kèm với PCRBIO Classic Taq đã được phát triển đặc biệt cho enzyme này và chúng tôi khuyến nghị cao việc sử dụng chúng cùng nhau. Tuy nhiên, PCRBIO Classic Taq nên tương thích với bất kỳ bộ đệm PCR nào được phát triển để sử dụng với Taq kiểu hoang dã. Nếu bạn sử dụng một bộ đệm tùy chỉnh với PCRBIO Classic Taq, hãy nhớ rằng các thông số phản ứng như nhiệt độ bắt cặp và nồng độ của enzyme, mẫu, dNTP và MgCl₂ có thể cần tối ưu hóa.

Có. Nếu bạn làm việc từ các thuộc địa vi khuẩn, hãy sử dụng đầu pipet vô trùng để lấy một thuộc địa và hòa tan vào phản ứng PCR 50µl. Nếu làm việc từ văn hóa lỏng, hãy thêm 5µl của văn hóa qua đêm vào hỗn hợp cuối cùng. Thực hiện theo quy trình tổng quát và tăng thời gian khởi đầu giải nén lên 10 phút ở 95°C.

Có. Sử dụng 2 µL mẫu máu cho phản ứng PCR 50 µL và làm theo quy trình tổng quát. Hãy nhớ rằng các thành phần trong máu có thể ức chế phản ứng PCR. Thực hiện một pha loãng tuần tự của mẫu để tìm nồng độ mẫu tối ưu cho việc khuếch đại PCR.

Không. PCRBIO Classic Taq có hoạt động exonuclease 5’-3’, nhưng không có hoạt động exonuclease 3’-5’ (chỉnh sửa).

Các sản phẩm PCR được tạo ra bởi PCRBIO Classic Taq có đuôi A, điều này làm cho nó phù hợp cho việc dòng vào các vectơ TA. Để biết thêm chi tiết, hãy xem tài liệu¹.

1  Yao, S., Hart, D. J. & An, Y. Những tiến bộ gần đây trong các phương pháp dòng TA phổ quát để sử dụng trong nghiên cứu chức năng. Protein Eng Des Sel, doi:10.1093/protein/gzw047 (2016).

Nếu các vết bẩn là mối quan tâm, thực hành tốt là đảm bảo rằng chúng không phải là hiện tượng giả do chạy điện di gel agarose với các điều kiện không tối ưu. Các điều kiện không tối ưu có thể bao gồm điện áp cao hoặc không cho đủ thời gian để gel đông đặc¹.

Bạn cũng có thể cần kiểm tra lại phản ứng PCR và xem xét các gợi ý dưới đây².

• Các mồi nên được thiết kế để ngăn chặn tương tác giữa các mồi và cải thiện tính đặc hiệu.
• Tăng nhiệt độ bắt cặp hoặc thực hiện PCR gradient nhiệt độ bắt cặp để xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu.
• Giảm lượng mẫu trong phản ứng. Đối với ADN chất lượng cao, sử dụng 1–100 ng ADN genomic hoặc ≤5 ng ADN plasmid/lambda cho mỗi phản ứng 50 µL.
• Giảm số vòng lặp.
• Giảm lượng enzyme cho mỗi phản ứng.
• Giảm nồng độ mồi, nhưng không thấp hơn 100 nM của mỗi mồi.
• Bổ sung DMSO vào phản ứng với nồng độ cuối cùng 5%–10%.

1  Koontz, L. Điện di gel agarose. Các phương pháp trong enzymology: ADN. Phiên bản đầu tiên, Tập 529 35-45 (2013).

2  Lorenz, T. C. Phản ứng chuỗi polymerase: quy trình cơ bản cộng với các chiến lược khắc phục và tối ưu hóa. J Vis Exp, e3998, doi:10.3791/3998 (2012).

Bạn có thể xem xét các gợi ý dưới đây và cũng tham khảo tài liệu¹.

• Tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp trong một PCR gradient nhiệt độ bắt cặp.
• Tăng lượng mẫu trong phản ứng.
• Tăng số vòng lặp.
• Tăng lượng enzyme cho mỗi phản ứng.
• Tăng nồng độ mồi, nhưng không vượt quá 1 µM của mỗi mồi.
• Thử một dung dịch dNTP mới.
• Tối ưu hóa MgCl₂

1  Lorenz, T. C. Phản ứng chuỗi polymerase: quy trình cơ bản cộng với các chiến lược khắc phục và tối ưu hóa. J Vis Exp, e3998, doi:10.3791/3998 (2012).

Khi nhận được, bộ kit nên được lưu trữ ở -20°C. Tránh để lâu dưới ánh sáng. Nếu được lưu trữ đúng cách, bộ kit sẽ giữ được hoạt tính đầy đủ trong 12 tháng. Bộ kit này có thể được lưu trữ ở 4°C trong 1 tháng.

Enzyme PCRBIO Classic Taq được cung cấp kèm theo 10x Bộ đệm PCRBIO Classic, với bộ đệm chứa 30 mM MgCl₂. Các dNTP được bán riêng và phải được thêm vào phản ứng cuối cùng. PCRBIO Taq DNA Polymerase được cung cấp kèm theo 5x Bộ đệm phản ứng PCRBIO, với bộ đệm chứa cả MgCl₂ và dNTP. Ngoài ra, PCRBIO Taq DNA Polymerase còn có sẵn dưới dạng 2x Mix để tiện lợi hơn, có và không có phẩm màu đỏ để nạp trực tiếp lên gel agarose.

Enzyme có tỷ lệ lỗi khoảng 1 lỗi cho mỗi 2.0 x 10⁵ nucleotide được đưa vào.

15 giây cho mỗi kilobase (kb) để khuếch đại từ ADN eukaryotic với các amplicon giữa 1kb và 6kb. Đối với các amplicon ngắn hơn, một lần mở rộng 1 giây là đủ.