qPCRBIO SyGreen® Mix

Thông tin bổ sung

qPCRBIO SyGreen® Mix được thiết kế cho qPCR dựa trên nhuộm sắc tố nhanh chóng, nhạy cảm cao và tái hiện được, với ít hoặc không cần tối ưu hóa. Hệ thống khởi động nóng thông qua kháng thể ngăn chặn sự hình thành các dimers mồi và các sản phẩm không đặc hiệu dẫn đến độ nhạy và đặc hiệu phản ứng được cải thiện đáng kể.

Hỗn hợp 2x của chúng tôi sử dụng một thuốc nhuộm intercalating DNA độc quyền, không cản trở PCR, không giống như các thuốc nhuộm huỳnh quang phổ biến khác. Những cải tiến làm tăng độ nhạy và tính đồng nhất của qPCRBIO SyGreen® Mix trong điều kiện chu kỳ tiêu chuẩn cũng cho phép hiệu suất hàng đầu trong điều kiện chu kỳ nhanh và siêu nhanh.

Sử dụng Công cụ Chọn lọc qPCR của chúng tôi để tìm ra biến thể ROX nào phù hợp với thiết bị của bạn.

qPCRBIO SyGreen® hoạt động như thế nào?

Những thuốc nhuộm intercalating này có các nhóm thơm và phẳng cho phép quá trình intercalation của phân tử trong khe nhỏ của DNA hai chuỗi span khoảng 3.5-4 nucleotides. Các nhóm dương có mặt ổn định các thuốc nhuộm cho phép sự phối hợp với cấu trúc xương DNA mang điện tích âm.

Do cơ chế gắn kết với DNA này, chúng không thể gắn kết với axit nucleic đơn chuỗi, trừ khi có cấu trúc thứ cấp được hình thành. Mặt khác, độ phát quang tăng lên tới 1,000 lần khi intercalate với dsDNA.

Khi một thuốc nhuộm intercalate giữa các cặp base DNA, nó phát ra ánh sáng phát quang tỷ lệ với số lượng thuốc nhuộm được gắn (và do đó là số lượng DNA trong mẫu). Điều này cho phép hình dung các axit nucleic trên gel hoặc fluorimeter trong các thiết bị qPCR theo thời gian thực. Trong trường hợp sau, số lượng phân tử thuốc nhuộm intercalate trong mẫu tăng lên với quá trình qPCR, dẫn đến việc tăng tương ứng ánh sáng phát quang với mỗi chu kỳ. Tại thời điểm bắt đầu phản ứng, thuốc nhuộm tự do phát ra mức độ phát quang cơ bản. Khi phản ứng tiếp tục, cường độ phát quang tăng lên theo cấp số nhân, trước khi đạt đến mức ổn định trong các chu kỳ sau, dẫn đến biểu đồ khuếch đại hình chữ S kinh điển.

Lợi ích và hạn chế của qPCR dựa trên thuốc nhuộm

Lợi ích:

• Phát hiện Mục tiêu Đa dạng: Bằng cách kết hợp thuốc nhuộm SyGreen hoặc loại SYBR Green với mồi, các nghiên cứu có thể phát hiện bất kỳ phân tử mục tiêu nào. Tính linh hoạt này cho phép thiết kế qPCR singleplex hiệu quả và đơn giản.
• Tích lũy Tín hiệu Phát quang Có thể Đảo ngược: Việc sử dụng thuốc nhuộm intercalating DNA tạo thuận lợi cho việc tích lũy tín hiệu phát quang có thể đảo ngược. Bởi vì phát quang mạnh chỉ phát sinh từ thuốc nhuộm intercalate, việc biến tính DNA dẫn đến việc giảm tín hiệu phát quang. Đặc điểm này cho phép thử nghiệm độ đặc hiệu thông qua phân tích đường tan, cho phép đánh giá nhanh chóng độ đặc hiệu của qPCR.

Hạn chế:

• Phát sinh Tín hiệu Không Đặc hiệu: Thuốc nhuộm intercalating có thể tạo ra các tín hiệu phát quang không đặc hiệu khi nó gắn kết với bất kỳ phân tử dsDNA nào trong ống phản ứng. Điều này có thể xảy ra do việc gắn mồi không chính xác, sự hiện diện của các trình tự tương tự trong mẫu, sự hình thành các dimers mồi, hoặc cấu trúc móc mồi có thể xảy ra. Để xác minh kết quả, cần thực hiện các phân tích bổ sung như phân tích đường tan, điện di gel, hoặc giải trình tự Sanger.
• Phép thử Mục tiêu Đơn: qPCR dựa trên thuốc nhuộm chỉ cho phép phân tích một mục tiêu cho mỗi phản ứng. Để định lượng nhiều mục tiêu trong một mẫu, cần thiết lập số lượng phản ứng tương ứng.

Phân tích Đường Tan

Phân tích đường tan phục vụ để xác định điểm chảy của sản phẩm qPCR, cung cấp thông tin quý giá về độ đặc hiệu của sản phẩm. Phân tích này bao gồm một bước nhiệt chu kỳ bổ sung vào cuối chương trình chu kỳ qPCR. Trong bước này, các mẫu phản ứng được dần dần biến tính bằng cách tăng dần nhiệt độ ủ trong khi thu thập dữ liệu phát quang tại mỗi khoảng nhiệt độ. Vẽ dữ liệu cường độ phát quang so với nhiệt độ tạo ra đường tan. Trong một phản ứng chứa sản phẩm cụ thể, cường độ phát quang giữ ổn định cho đến khi nhiệt độ gần đến điểm tan của mục tiêu, tại thời điểm đó nó nhanh chóng giảm xuống mức cơ bản. Nhiệt độ tại đó cường độ phát quang giảm xuống 50% của mức tối đa được coi là điểm tan hoặc Tm của phân tử đó. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng có thể được đơn giản hóa bằng cách vẽ đạo hàm bậc nhất của cường độ phát quang so với thay đổi nhiệt độ.

Để biết thêm thông tin chi tiết về qPCR dựa trên thuốc nhuộm hoặc qPCR nói chung, xin vui lòng tham khảo hướng dẫn kỹ thuật của chúng tôi.

Lưu ý:

SYBR Green là thương hiệu đã được đăng ký của Molecular Probes Inc. và thuộc sở hữu của Thermo Fischer Scientific. PCR Biosystems Ltd. hoàn toàn không liên kết với bất kỳ thực thể nào trong số này.