qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect

Các giá trị Ct có thể thay đổi tùy theo nồng độ mẫu, tối ưu hóa phản ứng, thiết bị và phòng thí nghiệm, vì vậy cần thận trọng khi chọn giá trị Ct cắt. Thông thường, các giá trị Ct trên 35 sẽ bắt đầu được coi là không đáng tin cậy. Tuy nhiên, giá trị Ct muộn có thể được quan sát thấy cho các phản ứng không hiệu quả khi sử dụng số lượng mẫu thấp. Thực hành tốt nên là chuẩn hóa các giá trị cắt bằng các phương pháp định lượng tương đối hoặc tuyệt đối. Cũng nên chạy và phân tích các đường cong nóng chảy hoặc gel của các sản phẩm để xác định sản phẩm của bất kỳ sự khuếch đại muộn nào.

ROX (6-carboxy-X-rhodamine) được sử dụng như một phẩm màu tham chiếu thụ động trong các thiết bị PCR thời gian thực phụ thuộc ROX để chuẩn hóa các biến động mức độ phát quang có thể xảy ra chủ yếu do biến động quang học giữa các giếng. Chuẩn hóa cường độ phát quang (Rn) được thực hiện trong phần mềm PCR thời gian thực bằng cách chia cường độ phát xạ của tín hiệu cụ thể cho cường độ phát xạ của ROX.

ROX không tham gia vào phản ứng PCR và mức độ phát quang của nó không tỷ lệ với lượng DNA trong mỗi giếng, vì vậy việc thêm fluorophore này vào hỗn hợp cung cấp một tín hiệu phát quang không đổi trong quá trình khuếch đại.

Các loại thiết bị PCR thời gian thực khác nhau yêu cầu một tiêu chuẩn tham chiếu thụ động có nồng độ ROX tối ưu khác nhau, chủ yếu là do các cấu hình quang học khác nhau của mỗi hệ thống (tức là loại nguồn kích thích và quang học khác nhau được sử dụng).

Việc thêm quá ít hoặc quá nhiều ROX sẽ dẫn đến tín hiệu rất ồn, ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng. Do đó, điều rất quan trọng đối với người dùng là:

1. Xác định nồng độ ROX chính xác để tối ưu hóa kết quả PCR thời gian thực, và
2. Kiểm tra cài đặt ROX trên phần mềm được sử dụng để thiết lập phản ứng.

Một công cụ chọn lựa hữu ích cho các hệ thống thường được sử dụng có thể được tìm thấy tại đây.

Chúng tôi khuyên dùng tối thiểu 2 phút để kích hoạt polymerase. Thời gian dài hơn lên đến 15 phút cũng có thể được sử dụng mà không ảnh hưởng xấu đến enzyme.

1 bước

Cả quá trình tổng hợp cDNA và phản ứng PCR diễn ra trong cùng một hỗn hợp. Lựa chọn này phù hợp cho các ứng dụng có thông lượng cao nhờ vào tốc độ và tính dễ thiết lập. Đồng thời, có nguy cơ ô nhiễm thấp hơn. Tuy nhiên, nó không lý tưởng cho các mẫu RNA có chất lượng thấp hoặc nếu cần cDNA để lưu trữ hoặc phân tích riêng biệt.

2 bước

Quá trình tổng hợp cDNA và phản ứng PCR diễn ra riêng biệt. Lựa chọn này tốt hơn nếu sản phẩm cDNA cần được giữ lại để phân tích. Nó cũng cho phép tối ưu hóa mức độ phản ứng cao hơn. Nó cho phép kiểm soát loại và nồng độ enzyme, đầu vào RNA và nồng độ cDNA, từ đó dẫn đến độ nhạy cao hơn so với định dạng 1 bước.

Không, UltraScript® RTase 20x chứa một chất ức chế RNase để ngăn ngừa sự phân hủy và tăng độ nhạy.

Nếu bạn quan sát thấy các giá trị Ct muộn bất thường, hãy thử pha loãng RNA mẫu. Bằng cách này, bạn đang pha loãng bất kỳ chất ức chế nào có thể có tại một nồng độ mà chúng không ức chế phản ứng. Ngoài ra, hãy thử tăng nhiệt độ phản ứng phiên mã ngược lên 55 °C và tăng nhiệt độ gia nhiệt/mở rộng. Điều này có thể giúp giải quyết những khó khăn do cấu trúc thứ cấp hiện diện trong mẫu RNA và/hoặc mồi.

Trong trường hợp có thể có sự ức chế phản ứng, hãy thử giảm lượng mẫu¹ hoặc thêm 0.4 – 4.4 mg/ml BSA vào phản ứng².

Để có những vấn đề cụ thể hơn, hãy liên hệ với technical@pcrbio.com cung cấp thông tin sau:

• Kích thước amplicon
• Cách thiết lập phản ứng
• Điều kiện chu trình
• Ảnh chụp màn hình của các đường khuếch đại và hồ sơ nhiệt độ nóng chảy

1 Scipioni et al. Một phương pháp RT-PCR SYBR Green trong một ống để phát hiện virus norovirus ở người và bò và kiểm soát sự ức chế. Virology Journal.5:94 (2008). doi: 1186/1743-422X-5-94

2 Plante et al. Việc sử dụng albumin huyết thanh bò để cải thiện việc phát hiện virus đường tiêu hóa từ rau quả rửa sạch. Applied Microbiology. 52:3 (2010) doi: https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2010.02989.x

Các sản phẩm khác nhau có thể sẽ cho một mức độ phát quang khác nhau. Tuy nhiên, điều này không ảnh hưởng đến độ chính xác định lượng và giá trị Ct sẽ không khác nhau giữa các sản phẩm.

Các bộ dựa trên mồi như qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect cung cấp độ nhạy cao hơn và không có khả năng cho khuếch đại không có mục tiêu. Các multiplex có thể được đo bằng cách sử dụng các amplicons với các fluorophore khác nhau cho các mồi cụ thể, điều này không thể đạt được bằng màu nhuộm.

Các hệ thống dựa trên phẩm màu như qPCRBIO SyGreen 1-Step Detect và 1-Step Go phát hiện bất kỳ dsDNA nguyên vẹn nào và do đó sẽ cho thấy sự dimmer của mồi và sự khuếch đại ngoài mục tiêu/khuếch đại không có mục tiêu. Những điều này có thể được tách ra khỏi các đỉnh sản phẩm bằng cách phân tích các đường cong nóng chảy.

ROX là một phẩm màu tham chiếu thụ động, có nghĩa là nó không tham gia vào phản ứng PCR. Nó được sử dụng để chuẩn hóa các biến động không liên quan đến PCR trong độ phát quang. Bạn có thể sử dụng Công Cụ Chọn Lựa qPCR của chúng tôi trong phần Tài Nguyên để xác định hỗn hợp qPCR nào của chúng tôi là phù hợp nhất cho máy qPCR của bạn.

Tất cả các hỗn hợp qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect 4x chứa MgCl₂ tại nồng độ 18 mM. Điều này có nghĩa là nồng độ cuối cùng trong phản ứng là 4.5 mM.

Các mồi đặc hiệu cho gen có thể được sử dụng trong phản ứng 1 bước.

Các mồi cần được thiết kế để đảm bảo rằng chúng có nhiệt độ gắn kết tương tự, đặc hiệu với mục tiêu và không tạo thành dimmer mồi. Thời gian của giai đoạn phiên mã ngược có thể được kéo dài lên 10 phút để đảm bảo đủ mẫu cho việc gắn mồi và khuếch đại.

Chúng tôi khuyên dùng 400-1000 nM cho mỗi mồi. Có một mức độ linh hoạt quanh nồng độ được khuyến nghị này, tuy nhiên nồng độ mồi không nên tăng lên quá mức này vì có thể ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động của enzyme.