PCRBIO HiFi Polymerase

Bộ đệm PCRBIO HiFi 5x đi kèm với PCRBIO HiFi Polymerase đã được phát triển đặc biệt cho enzyme này và chúng tôi rất khuyến nghị sử dụng chúng cùng nhau. Tuy nhiên, PCRBIO HiFi Polymerase nên tương thích với bất kỳ bộ đệm PCR nào được phát triển để sử dụng với Pfu polymerase. Nếu bạn sử dụng bộ đệm tùy chỉnh với PCRBIO HiFi Polymerase, hãy nhớ rằng các tham số phản ứng như nhiệt độ hồi phục và nồng độ enzyme, mạch khuôn, dNTPs và MgCl₂ có thể cần được tối ưu hóa.

Có. Nếu bạn làm việc từ các thuộc địa vi khuẩn, hãy sử dụng một đầu tip vô trùng để chọn một thuộc địa và hòa tan vào phản ứng PCR 50µl. Nếu làm việc từ nuôi cấy lỏng, hãy thêm 5µl của nuôi cấy qua đêm vào hỗn hợp cuối cùng. Theo dõi quy trình chung và tăng thời gian biến tính ban đầu lên 10 phút ở 95°C.

PCRBIO HiFi Polymerase không chứa công nghệ khởi động nóng, tuy nhiên nó có hoạt động nội tại thấp ở nhiệt độ thấp, thấp hơn nhiều so với Taq Polymerase không có khởi động nóng. Điều này có nghĩa rằng nó có thể được sử dụng cho một số ứng dụng multiplex.

Khi lần đầu thực hiện PCR đa mục tiêu, chúng tôi khuyến nghị thực hiện một gradient nhiệt độ hồi phục từ 55°C đến 65°C. Nhiệt độ hồi phục mà cho độ đặc hiệu tốt nhất nên được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo. Điều kiện chu trình nhanh không nên được sử dụng cho PCR đa mục tiêu. Chúng tôi khuyến nghị thời gian kéo dài là 90 giây để bắt đầu và thời gian này có thể được kéo dài để tăng năng suất.

Đối với các phản ứng đa mục tiêu, các phản ứng nên được thiết lập trên đá hoặc khối lạnh từ đầu đến cuối. Các mồi phải được thiết kế cẩn thận để tránh các chuỗi chồng chéo càng nhiều càng tốt trong khi vẫn duy trì độ dài amplicon đa dạng có thể được phân tích dễ dàng với phương pháp phát hiện cuối của bạn^1-3. Xin hãy lưu ý về các giới hạn chiều dài amplicon cho PCRBIO HiFi Polymerase. Nếu một trong các amplicon của bạn gần giới hạn, hãy xem xét việc sử dụng VeriFi® Polymerase.

1  Markoulatos, P., Siafakas, N. & Moncany, M. Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach. J Clin Lab Anal 16, 47-51, doi:10.1002/jcla.2058 (2002).

2  Radhika, M., Saugata, M., Murali, H. S. & Batra, H. V. A novel multiplex PCR for the simultaneous detection of Salmonella enterica and Shigella species. Brazilian Journal of Microbiology 45, 667-676, doi:10.1590/s1517-83822014005000041 (2014).

3  Perez-Perez, F. J. & Hanson, N. D. Detection of plasmid-mediated AmpC beta-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR. J Clin Microbiol 40, 2153-2162, doi:10.1128/jcm.40.6.2153-2162.2002 (2002).

Có. PCRBIO HiFi Polymerase có hoạt động exonuclease 3’-5’ (sửa lỗi).

Nếu dấu vết là một quan ngại, điều tốt là đảm bảo rằng chúng không phải là sản phẩm của việc chạy điện di gel agarose với điều kiện không tối ưu. Các điều kiện không tối ưu có thể bao gồm điện áp cao hoặc không cho đủ thời gian để gel thiết lập¹.

Bạn cũng có thể cần khắc phục phản ứng PCR và xem xét các gợi ý và tài liệu dưới đây².

• Các mồi nên được thiết kế để ngăn chặn các tương tác mồi-mồi và cải thiện độ đặc hiệu.
• Tăng nhiệt độ hồi phục hoặc thực hiện một gradient nhiệt độ hồi phục PCR để xác định nhiệt độ hồi phục tối ưu.
• Giảm lượng mạch khuôn trong phản ứng. Đối với DNA chất lượng cao, sử dụng 1–100 ng DNA toàn bộ hoặc ≤5 ng DNA plasmid/lambda cho mỗi 50 µL phản ứng.
• Giảm số vòng.
• Giảm lượng enzyme cho mỗi phản ứng.
• Giảm nồng độ mồi, nhưng không thấp hơn 100 nM cho mỗi mồi.
• Bao gồm DMSO trong phản ứng đến nồng độ cuối cùng 5%–10%.

1  Koontz, L. Agarose Gel Electrophoresis. Laboratory methods in enzymology : DNA. First edition. edn, Vol. 529 35-45 (2013).

2  Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp, e3998, doi:10.3791/3998 (2012).

Bạn có thể muốn xem xét các gợi ý dưới đây và cũng tham khảo tài liệu¹.

• Tối ưu hóa nhiệt độ hồi phục trong một gradient nhiệt độ hồi phục PCR.
• Tăng lượng mạch khuôn trong phản ứng.
• Tăng số vòng.
• Tăng lượng enzyme cho mỗi phản ứng.
• Tăng nồng độ mồi, nhưng không vượt quá 1 µM cho mỗi mồi.
• Thử một dung dịch dNTP mới.
• Tối ưu hóa MgCl₂

1  Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp, e3998, doi:10.3791/3998 (2012).

VeriFi® Polymerase có khả năng tiến trình vượt trội hơn so với PCRBIO HiFi Polymerase, dẫn đến thời gian kéo dài ngắn hơn (10-30 s/kb), sản lượng cao hơn và khả năng khuếch đại các mục tiêu dài hơn (lên đến 17.5 kb) và khó hơn. VeriFi® Polymerase cũng có độ tin cậy cao hơn so với PCRBIO HiFi Polymerase. Không giống như PCRBIO HiFi polymerase, VeriFi® Polymerase có sẵn dưới dạng hỗn hợp 2x tiện lợi với tùy chọn phẩm màu đỏ cho việc nạp gel trực tiếp, tiết kiệm thời gian trong quá trình thiết lập và phân tích phản ứng.

PCRBIO HiFi Polymerase có tỷ lệ lỗi khoảng 1 lỗi trên 4.5 x 10⁷ nucleotide được đưa vào. Điều này thấp hơn hơn 50 lần so với PCRBIO Taq DNA polymerase.

30 giây mỗi kilobase (kb) được khuyến nghị cho việc khuếch đại từ DNA eukaryotic. Thời gian kéo dài có thể được rút ngắn cho DNA virus và vi khuẩn.

Các sản phẩm PCR được tạo ra bởi PCRBIO HiFi polymerase có đầu phẳng, làm cho chúng phù hợp cho việc nhân bản đầu phẳng mà không cần bất kỳ sửa đổi nào thêm.

Nếu bạn muốn thêm đầu A, bạn có thể sử dụng Taq DNA Polymerase hoặc Klenow (exo-) DNA rồi theo sau bằng nhân bản TA¹. Trước khi tiến hành thêm đầu A, hãy đảm bảo rằng PCRBIO HiFi polymerase đã được loại bỏ khỏi phản ứng. Nếu có bất kỳ PCRBIO HiFi Polymerase nào còn lại, hoạt động exonuclease 3’-5’ của enzyme có thể loại bỏ các đầu A.

1  Yao, S., Hart, D. J. & An, Y. Recent advances in universal TA cloning methods for use in function studies. Protein Eng Des Sel, doi:10.1093/protein/gzw047 (2016).