NGSBIO Library Quant Kit Blue for Illumina

Kiểm tra đường cong nóng chảy để đảm bảo có một đỉnh duy nhất. Nếu bạn thấy nhiều đỉnh, có thể có ô nhiễm hoặc các đầu nối chưa liên kết. Nếu mẫu xuất hiện trước DNA Standard 1, hãy pha loãng mẫu 100 lần và thực hiện lại. Nếu các mẫu xuất hiện sau DNA Standard 5, hãy sử dụng mẫu có nồng độ cao hơn 100 lần.

Nếu hiệu suất tổng thể của đường cong tiêu chuẩn của bạn nằm trong khoảng 90% – 110% và giá trị R² của bạn gần bằng 1, thì đây không phải là nguyên nhân đáng lo ngại. Miễn là độ dốc của đường thẳng qua tất cả các tiêu chuẩn nằm trong khoảng 3.1 – 3.6, phép định lượng sẽ chính xác.

Kiểm tra đường cong để tìm các điểm ngoại lai. Nếu bất kỳ điểm dữ liệu nào xuất hiện xa khỏi đường cong phù hợp, hãy xóa điểm dữ liệu đó và xem liệu hiệu suất có cải thiện không. Cần tối thiểu ba tiêu chuẩn cho một đường cong tiêu chuẩn đáng tin cậy, vì vậy có thể xóa tối đa hai tiêu chuẩn hoàn toàn. Tuy nhiên, mỗi tiêu chuẩn cần ít nhất hai phép đo, và chỉ các mẫu nằm trong các tiêu chuẩn còn lại mới có thể được định lượng.

Kiểm tra No Template Control (NTC) để đảm bảo nó có Cq lớn hơn DNA Standard 5. Nếu NTC nằm trong phạm vi tiêu chuẩn, có thể có ô nhiễm trong các tiêu chuẩn hoặc hỗn hợp phản ứng. Điều này có thể đến từ các mẫu khác trên đĩa hoặc dấu vết của các thư viện khác còn lại trên bề mặt hoặc thiết bị trong phòng thí nghiệm. Vệ sinh tất cả dụng cụ và bề mặt một cách kỹ lưỡng và thực hiện lại thí nghiệm với các mẫu thuốc thử mới.

Nếu đỉnh trùng với phần vai nhìn thấy trong các đỉnh nóng chảy của tiêu chuẩn, thì có thể là sự khuếch đại của các đầu nối Illumina®. Điều này có thể xảy ra khi tỷ lệ đầu nối/mẫu quá cao hoặc khi có một lượng lớn các đầu nối chưa liên kết. Nếu đỉnh đó quan trọng, kết quả định lượng không đáng tin cậy và thí nghiệm nên được thực hiện lại. Đảm bảo rằng lượng đầu nối chính xác được thêm vào hỗn hợp chính và sử dụng nồng độ mẫu cao hơn nếu có thể. Nếu vấn đề vẫn tiếp diễn, thư viện có thể cần trải qua bước phân loại kích thước để loại bỏ các đầu nối tự do.

Nếu nhiều đỉnh xuất hiện không tương ứng với đỉnh đầu nối, nguyên nhân có thể là ô nhiễm hoặc không thành công trong việc chọn kích thước trong quá trình chuẩn bị thư viện. Thực hiện lại phép đo với các pha loãng mới của thư viện. Nếu vấn đề vẫn tiếp diễn, thư viện đó có thể cần phải trải qua thêm bước chọn kích thước.

Việc thấy một phần vai nhẹ ở phía nhiệt độ thấp của đỉnh nóng chảy mẫu là bình thường. Nếu phần vai rất lớn, có thể đã thêm quá nhiều hỗn hợp đầu nối Illumina® hoặc không thêm đủ lượng tiêu chuẩn. Trong trường hợp này, thí nghiệm nên được thực hiện lại với sự chú ý đặc biệt khi chuẩn bị hỗn hợp chính và khi thêm các tiêu chuẩn vào phản ứng.

Nếu có nhiều đỉnh được quan sát trong các đường cong nóng chảy của tiêu chuẩn, thì ô nhiễm đã được đưa vào phản ứng. Nếu nó có mặt trong tất cả các tiêu chuẩn, thì ô nhiễm nằm trong hỗn hợp chính. Thí nghiệm nên được thực hiện lại với các mẫu thuốc thử mới. Nếu nó chỉ có mặt trong các bản lặp của một tiêu chuẩn duy nhất, thì mẫu tiêu chuẩn đó đã bị ô nhiễm và phải được loại bỏ.

Nếu giá trị R² không gần bằng 1, điều này cho thấy các tiêu chuẩn không được phân bố đều. Kiểm tra biểu đồ đường cong tiêu chuẩn và loại bỏ bất kỳ điểm nào xa khỏi đường thẳng. Miễn là có ba tiêu chuẩn với hai phép đo mỗi tiêu chuẩn, phép định lượng sẽ chính xác.

Nếu bạn không thể cải thiện chất lượng của phép fit đến mức cần thiết, thí nghiệm nên được thực hiện lại. Hãy cẩn thận hơn khi pipet các tiêu chuẩn để đảm bảo thể tích chính xác và ngăn ngừa ô nhiễm.

Các thiết bị như Qubit hoặc một quang phổ kế đo tổng lượng DNA có trong dung dịch. Điều tương tự cũng đúng với các phép đo nồng độ của Agilent Bioanalyser. Bộ dụng cụ Định lượng Thư viện NGSBIO cho Illumina® chỉ định lượng các phân tử mà có cả hai đầu nối. Thêm vào đó, qPCR là một phương pháp chính xác hơn để định lượng DNA so với các phương pháp huỳnh quang hoặc quang phổ. Thật bình thường khi các phương pháp đo khác nhau không đồng nhất.

Nếu nồng độ đo bằng qPCR thấp hơn nhiều so với phương pháp khác, điều này cho thấy chỉ một tỷ lệ nhỏ phân tử đã liên kết đúng đầu nối trong quá trình liên kết đầu nối.

Kiểm tra các đường cong nóng chảy để đảm bảo có một đỉnh sản phẩm duy nhất. Nếu có nhiều đỉnh, điều này cho thấy mẫu có thể đã bị ô nhiễm hoặc phân hủy, hoặc có lỗi xảy ra trong quá trình chọn kích thước hoặc liên kết đầu nối hoặc chuẩn bị thư viện. Nếu phân tích nóng chảy chỉ cho thấy một đỉnh, thì sự biến đổi có thể do việc pipet không chính xác. Tạo một pha loãng mới của mẫu và thực hiện lại thí nghiệm, đừng quên pipet các bản sao một cách chính xác. Nếu vấn đề vẫn tiếp diễn, có thể cần tạo một thư viện mới.

Sự biến đổi ± 0.2 chu kỳ giữa các bản sao là bình thường. Kiểm tra các đường cong nóng chảy để đảm bảo có một đỉnh sản phẩm duy nhất. (Có thể có phần vai trọng lượng phân tử thấp hơn, điều này là bình thường). Nếu có nhiều đỉnh, điều này cho thấy các tiêu chuẩn đã bị ô nhiễm hoặc phân hủy. Nếu tiêu chuẩn đó có thể được loại bỏ khỏi phân tích, hãy làm như vậy. Nếu không, hãy đặt hàng các tiêu chuẩn mới và thực hiện lại thí nghiệm.

Nếu các đường cong nóng chảy cho thấy một đỉnh duy nhất trong các bản sao, sự biến đổi có thể do việc pipet không chính xác. Thực hiện lại thí nghiệm, chú ý pipet các tiêu chuẩn một cách chính xác.