Clara® Probe Mix

Các giá trị Ct có thể thay đổi giữa các nồng độ mẫu, tối ưu hóa phản ứng, thiết bị và phòng thí nghiệm, vì vậy cần thận trọng khi chọn một giá trị Ct cắt. Thông thường, các giá trị Ct trên 35-40 sẽ bắt đầu được coi là không đáng tin cậy. Tuy nhiên, giá trị Ct muộn có thể được quan sát đối với các phản ứng không hiệu quả với số lượng mẫu thấp. Thực hành tốt là luôn chuẩn hóa các giá trị cắt bằng các phương pháp định lượng tương đối hoặc tuyệt đối. Cũng nên chạy và phân tích đường trưởng thành hoặc gel của các sản phẩm để xác định sản phẩm của bất kỳ sự khuếch đại muộn nào.

Có, các sản phẩm PCR được tạo ra bằng những hỗn hợp này có các đặc điểm giống như các sản phẩm PCR được tạo ra bằng Taq polymerase hoang dã. Chúng có thể được giải trình tự hoặc tiêu hóa bằng các endonuclease giới hạn theo các giao thức tiêu chuẩn. Sản phẩm có phần đuôi 3′-d(A) và có thể được sử dụng cho việc clon TA hoặc có thể được kết thúc bằng blunt hoặc tiêu hóa bằng các enzyme giới hạn trước khi clon. Để có kết quả tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên tinh chế các sản phẩm PCR bằng bất kỳ bộ tinh sạch PCR tiêu chuẩn nào.

ROX (6-carboxy-X-rhodamine) được sử dụng như một thuốc nhuộm tham chiếu thụ động trong các thiết bị PCR thời gian thực phụ thuộc ROX để chuẩn hóa các biến động mức độ phát quang có thể xảy ra chủ yếu do biến đổi quang học giữa các giếng. Việc chuẩn hóa cường độ phát quang (Rn) được thực hiện trong phần mềm PCR thời gian thực bằng cách chia cường độ phát xạ của tín hiệu cụ thể cho cường độ phát xạ của ROX.

ROX không tham gia vào phản ứng PCR và mức độ phát quang của nó không tỉ lệ với số lượng DNA trong mỗi giếng, do đó việc thêm fluorophore này vào hỗn hợp cung cấp tín hiệu phát quang không đổi trong quá trình khuếch đại.

Các loại thiết bị PCR thời gian thực khác nhau yêu cầu tiêu chuẩn tham chiếu thụ động có nồng độ ROX tối ưu khác nhau, chủ yếu do các cấu hình quang học khác nhau của mỗi hệ thống (tức là loại nguồn kích thích và quang học khác nhau được sử dụng).

Việc thêm quá ít hoặc quá nhiều ROX sẽ tạo ra tín hiệu rất ồn gây ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng. Do đó, điều rất quan trọng đối với người dùng là:

1. Xác định nồng độ ROX đúng để tối ưu hóa kết quả PCR thời gian thực, và
2. Kiểm tra cài đặt ROX trên phần mềm được sử dụng để thiết lập phản ứng

Một công cụ lựa chọn hữu ích cho các hệ thống thường được sử dụng nhất có thể tìm thấy tại đây.

Không. Ngoài ROX (nếu có trong bộ), không có phẩm nhuộm nào khác trong các hỗn hợp của chúng tôi. Bạn có thể sử dụng bất kỳ probe liên hợp fluorophore nào cho phản ứng của bạn.

Các sản phẩm khác nhau có thể cho ra mức độ phát quang cao khác nhau. Tuy nhiên, điều này không ảnh hưởng đến độ chính xác của định lượng và giá trị Ct sẽ không khác nhau giữa các sản phẩm.

Có, đệm bảo quản này tương thích. EDTA sẽ chelat một số magnesi trong hỗn hợp, nhưng không đủ đáng kể để ảnh hưởng đến phản ứng.

Các hỗn hợp Clara® Probe Purple và Clara® Probe 1-Step Purple chứa các thuốc nhuộm tham chiếu thụ động có các công thức khác nhau, mỗi công thức có một nồng độ khác nhau của thuốc nhuộm tham chiếu thụ động:

Các hỗn hợp Lo-ROX (PB20.65 và PB25.85) chứa 200 nM ROX.
Các hỗn hợp Hi-ROX (PB20.66 và PB25.86) chứa 2 µM ROX.
Các hỗn hợp No-ROX (PB20.67 và PB25.87) không chứa ROX.

Các hỗn hợp Separate-ROX (PB20.68 và PB25.88) bao gồm một ống riêng chứa 50 µM chất bổ sung ROX. Điều này cho phép bạn chọn nồng độ ROX mà bạn muốn sử dụng.
Bạn có thể sử dụng Công cụ Lựa chọn qPCR của chúng tôi trong menu xổ xuống Tài nguyên để xác định các hỗn hợp nào của chúng tôi phù hợp nhất cho máy qPCR của bạn.

ROX là một thuốc nhuộm tham chiếu thụ động có nghĩa là nó không tham gia vào phản ứng PCR. Nó được sử dụng để chuẩn hóa các biến động không liên quan đến PCR trong độ phát quang. Bạn có thể sử dụng Công cụ Lựa chọn qPCR của chúng tôi trong phần Tài nguyên để xác định hỗn hợp qPCR nào của chúng tôi phù hợp nhất với máy qPCR của bạn.

Nếu quan sát thấy sự ức chế, lượng mẫu trong phản ứng có thể được giảm bớt. Điều này sẽ làm tăng giá trị Ct nhưng giảm khả năng các chất ức chế can thiệp vào hoạt động của Taq DNA polymerase. Nếu điều này không hiệu quả, hãy thử thêm 0.4-4 mg/ml BSA vào phản ứng^1,2. Đảm bảo các điều kiện chu kỳ trong hướng dẫn sản phẩm của chúng tôi được tuân thủ.

1. Kreader, C. A. Giải phóng sự ức chế khuếch đại trong PCR với albumin huyết thanh bò hoặc protein T4 gene 32. Appl Environ Microbiol 62, 1102-1106 (1996).
2. Wilson, I. G. Ức chế và tăng cường khuếch đại axit nucleic. Appl Environ Microbiol 63, 3741-3751 (1997).

Đã có báo cáo rằng hiệu suất có thể giảm với các pha loãng sau cho đường chuẩn. Chúng tôi khuyên bạn nên tránh điều này bằng cách pha loãng các tiêu chuẩn trong 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 0.05% Tween-20. EDTA là một tác nhân chelat và nó có vai trò trong việc ngăn chặn hoạt động của DNAse¹. Tween-20 là một chất tẩy rửa và ngăn chặn DNA bám vào thành ống². Hầu hết các máy ly tâm vi mô đều được làm từ polypropylene và nghiên cứu đã chứng minh rằng DNA bám rất chặt vào polypropylene³.

Các tiêu chuẩn không nên được đông lạnh sau khi pha loãng. Ngay cả trong sự hiện diện của chất tẩy rửa, việc đông lạnh dường như gây ra DNA gắn kết không thể đảo ngược vào polypropylene. Chúng tôi đề nghị giữ tiêu chuẩn của bạn ở 4°C và chuẩn bị một lô mới mỗi vài tuần.

1. Barra, G. B. et al. Ức chế liên quan đến EDTA của DNases bảo vệ DNA tự do trong máu khỏi bị phân hủy ex vivo trong các mẫu. Clin Biochem 48, 976-981, doi:10.1016/j.clinbiochem.2015.02.014 (2015).
2. Linnarsson, S. Những tiến bộ gần đây trong các phương pháp giải trình tự DNA – nguyên tắc chung về chuẩn bị mẫu. Exp Cell Res 316, 1339-1343, doi:10.1016/j.yexcr.2010.02.036 (2010).
3. Gaillard, C. & Strauss, F. Tránh hấp thụ DNA vào ống polypropylene và biến tính các đoạn DNA ngắn. Mẹo Kỹ thuật Trực tuyến 3, 3 (1998).

Có nhiều tùy chọn để xem xét khi tối ưu hóa phản ứng:

• Giảm thời gian gắn kết/mở rộng xuống 5 giây
• Tăng nhiệt độ gắn kết/mở rộng từ 60 lên 65°C

Pha loãng DNA mẫu bằng cách bắt đầu với 5 ng DNA và sử dụng một loạt pha loãng mẫu 10 lần. Ngoài việc chạy những cái này trên gel để xem liệu các sản phẩm không cụ thể có tồn tại hay không, hiệu suất của phản ứng có thể được tính toán bằng phần mềm của thiết bị qPCR sau khi pha loãng mẫu. Nếu hiệu suất nằm trong khoảng 90 – 110%, thì amplicon đang được gấp đôi mỗi chu kỳ.

Các giá trị Ct cao hơn thường chỉ ra sự khuếch đại chậm. Điều này có thể chủ yếu do sự dư thừa của mẫu trong phản ứng dẫn đến các mồi và probe bị ràng buộc trên các phân tử DNA khác nhau. Các mẫu thường có nhiều DNA ngoài gen mục tiêu và điều này có thể phân tán các oligo. Chúng tôi khuyên bạn nên pha loãng các mẫu (10x-1000x) để giải quyết vấn đề này.

Hơn nữa, nhiệt độ gắn kết/mở rộng cũng có thể được tăng lên để làm cho việc gắn kết của các oligo đặc hiệu hơn với chuỗi mục tiêu và giảm tín hiệu nền.

Chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng 0.4 µM cho mỗi mồi. Có một mức độ linh hoạt quanh nồng độ khuyến nghị này, tuy nhiên, nồng độ mồi không nên được tăng lên, vì điều này có thể ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động của enzyme.

Để biết thêm thông tin về việc đa mồi, vui lòng tham khảo Hướng dẫn Kỹ thuật qPCR.

Điều này rất có thể là do thời gian cho bước 1^st (bắt đầu nóng) quá ngắn. Đảm bảo rằng giai đoạn bắt đầu nóng được thực hiện ở 95°C trong 2 phút để kích hoạt hoàn toàn enzyme. Hồ sơ nhiệt độ được khuyến nghị là:

• 95°C (120 giây)
• 40 chu kỳ: 95°C (5-15 giây) – 60°C (20-30 giây)
• Đường trưởng thành

Nếu vẫn thu được các sản phẩm không cụ thể, chúng tôi khuyên bạn nên nâng nhiệt độ gắn kết/mở rộng từ 60°C lên 65°C, tùy thuộc vào bộ mồi được sử dụng.