Air-Dryable Inhibitor-Tolerant qPCR Probe Mixes

Điều kiện sấy được cung cấp trong hướng dẫn sử dụng sản phẩm chỉ là một ví dụ về các chu kỳ đã được thử nghiệm tại phòng thí nghiệm của chúng tôi. Khi sấy bằng không khí, điều quan trọng là phải đạt được lượng mất nước (Loss on Drying, LoD) khoảng 70-75%, dẫn đến một dạng gel khô chỉ chứa 5-10% nước.

Thời gian sấy có thể thay đổi tùy thuộc vào thiết bị sử dụng. Khi sử dụng sản phẩm này lần đầu tiên với một lò cụ thể, chúng tôi khuyên bạn nên đo LoD bằng nhiều ống trong các khoảng thời gian đều đặn (ví dụ: sau 60, 70, 80, 90 phút) để xác định giao thức tốt nhất và đạt được LoD là 74.5 ± 10.5% hoặc 70 ± 1% tùy thuộc vào hỗn hợp (có hoặc không có oligos) và thiết bị sấy đã sử dụng.

Nhiệt độ cũng có thể được thay đổi, nhưng rõ ràng nhiệt độ thấp hơn cần thời gian lâu hơn, trong khi nhiệt độ cao hơn có nguy cơ ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của các thành phần trong hỗn hợp, do đó chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng 40 °C để giảm thiểu khả năng gặp phải các vấn đề không mong muốn.

Kết quả khuếch đại đáng tin cậy cho nhiều mục tiêu khác nhau đã được đạt được bằng cách sử dụng 40 chu kỳ với 1 giây làm đông và 3 giây liên kết và mở rộng (chu trình 2 bước). Kết quả khuếch đại thành công trong các điều kiện này yêu cầu các amplicon có chiều dài ngắn hợp lý và nên được thử nghiệm từng trường hợp cho tất cả các mục tiêu mới được thêm vào thí nghiệm.

Mặc dù chúng tôi đã thành công trong việc lyophil hóa hỗn hợp này, nhưng chúng tôi không khuyến nghị điều đó. Hàm lượng tá dược đã được tối ưu hóa cho việc sấy khô bằng không khí và điều này làm giảm đáng kể tính ổn định của sản phẩm trong quá trình lyophil hóa. Chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng hỗn hợp này chỉ cho sấy khô bằng không khí và khuyến nghị dãy sản phẩm Lyo-Ready của chúng tôi cho các giao thức lyophil hóa.

Kết quả sẽ khác nhau tùy thuộc vào loài cây và loại mô. Hóa chất chống ức chế của chúng tôi cho thấy khả năng kháng vừa phải với diệp lục và polyphenol, chẳng hạn như catechin và quercetin, nhưng kháng lực thấp với axit tannic, cellulose và pectin. Do đó, việc thử nghiệm hỗn hợp trên các loại mẫu mong muốn là cần thiết. Tất cả các mô thực vật sẽ yêu cầu sự phân tán cơ học trong một dung dịch chiết xuất thích hợp để đạt được sự phá hủy thành tế bào và màng trước khi sử dụng với các hỗn hợp chống ức chế. Chúng tôi khuyên bạn nên thử nghiệm một số phản ứng nhỏ trên loại mẫu mục tiêu. Vui lòng liên hệ với đội ngũ của chúng tôi info@pcrbio.com để yêu cầu mẫu sản phẩm, hoặc nếu bạn cần hỗ trợ trong việc lập kế hoạch cho các phản ứng thử nghiệm như vậy.

Các mẫu nước bọt không yêu cầu xử lý trước. Tuy nhiên, việc pha loãng trong môi trường vận chuyển mẫu thích hợp là được khuyến nghị. Chúng tôi rất khuyến nghị sử dụng UTM không chứa guanidinium chloride.

Chúng tôi đã thực hiện thành công các phản ứng đa mạch trên tối đa 5 μL mẫu máu (1.25 μL máu thô được pha loãng 1:4 trong dung dịch NaCl/EDTA) cho mỗi phản ứng 20 μL. Điều này dẫn đến sự giảm tổng thể fluorescence nhưng không ức chế các phản ứng qPCR, cũng như không giới hạn độ nhạy của hỗn hợp.

Chúng tôi đã thử nghiệm thành công với tối đa 10% nước bọt thô cho mỗi phản ứng, với kết quả tốt nhất và nhất quán nhất khi sử dụng 2.5% nước bọt.

Có. Trong khi hỗn hợp này chịu ức chế tốt, nhưng nó không hoàn toàn miễn dịch với sự hiện diện của chất ức chế. Các chất ức chế khác nhau và nồng độ cao hơn vẫn có thể ức chế các phản ứng qPCR. Do độ nhạy của hỗn hợp, nếu thấy độ trễ đáng kể, chúng tôi khuyên bạn nên pha loãng mẫu trước khi sử dụng trong các phản ứng qPCR.

Có, điều này là kỳ vọng. Các mẫu sinh học thô, đặc biệt là nước bọt, chứa các mức độ khác nhau của chất ức chế PCR. Chúng tôi đã quan sát thấy một mức độ trễ từ 0.5-3.5 chu kỳ trong khuếch đại của cùng một mục tiêu với các mẫu nước bọt khác nhau. Cùng một mẫu sinh học thô cũng có thể cho thấy các mức độ ức chế khác nhau theo thời gian.

Tất cả các hỗn hợp chịu ức chế của chúng tôi đã được thử nghiệm và chịu đựng nước bọt thô và máu thô. Ngoài ra, chúng đã được thử nghiệm rộng rãi trong sự hiện diện của nhiều chất ức chế PCR có trong các hóa chất lâm sàng, thực vật, môi trường và phòng thí nghiệm. Những chất này bao gồm: hemin, hemoglobin, heparin, lactoferrin, IgG immunoglobulins, guanidine, SDS, ethanol, ure, natri citrate, acid humic, cellulose, pectin, quercetin, catechin, acid tannic và chlorophyll B. Mức độ chịu đựng thay đổi theo hợp chất. Các hỗn hợp cũng có thể chịu đựng các hợp chất khác, không được liệt kê, hoặc chưa được thử nghiệm.

Chúng tôi không khuyến nghị sấy khô hơn 5 – 6 μL hỗn hợp (cộng oligos) mỗi giếng theo hướng dẫn trong tài liệu. Nhiều đĩa có thể được sấy cùng lúc để tăng sản lượng sản xuất. Chúng tôi không khuyến nghị sấy khô bằng không khí các thể tích lớn hơn và khuyên nên sử dụng lyophil hóa, sử dụng dãy sản phẩm Lyo-Ready của chúng tôi.