Đạt được kết quả nhất quán, tin cậy với Hỗn hợp Mix dùng mẫu dò (Probe Mixes) Kháng chất ức chế và Có thể sấy khô.
Được thiết kế hoàn hảo để phân tích các loại mẫu khó, bao gồm nước bọt, mẫu lâm sàng, mẫu môi trường và các hóa chất phòng thí nghiệm. Với khả năng tương thích với tất cả các thiết bị Real-time PCR, các hóa chất có thể sấy khô này cho phép thực hiện qPCR để phát hiện cả DNA và RNA. Hỗn hợp Air-Dryable Inhibitor-Tolerant qPCR mix là sự kết hợp giữa công thức hóa học kháng chất ức chế mới lạ với công nghệ sấy khô tiên tiến.
Hỗn hợp Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe Mixes đã được kiểm chứng chuyên sâu với:
- Nước bọt thô (10%)
- Máu thô (6%)
- Hóa chất phòng thí nghiệm (SDS, guanidine, ethanol)
- Chất ức chế lâm sàng (hemin, hemoglobin, heparin, lactoferrin, immunoglobulins, urea)
- Chất ức chế từ thực vật và môi trường (humic acid, catechin, quercetin, tannic acid, cellulose, và chlorophyll).
Đặc tính nổi bật
- Chu trình nhiệt tiêu chuẩn và siêu nhanh: (Phản ứng RT chỉ mất 3 phút, biến tính trong 1 giây, gắn mồi/kéo dài trong 3 giây cho PCR).
- Kháng chất ức chế phổ rộng.
- Phát hiện nhạy và không sai lệch đối với cả mục tiêu DNA và RNA.
- Hỗn hợp RT-qPCR 1 bước hoàn chỉnh, định dạng trong một ống duy nhất.
- Thiết lập phản ứng dễ dàng: chỉ cần thêm mồi (primers) và mẫu dò (probes) trước khi sấy.
- Quy trình sấy khô nhanh: thời gian sấy từ 80-90 phút.
- Hiệu suất cao đồng nhất trước và sau khi sấy.
- Ổn định ở nhiệt độ phòng ít nhất 12 tháng sau khi sấy.
- Lưu trữ và vận chuyển các phản ứng đã sấy ở nhiệt độ môi trường.
Hình 1. Độ ổn định của hỗn hợp Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix sau 12 tuần ở 37 °C.
Ba mục tiêu RNA (B2M (β-microtubulin), γ-Actin, và GAPDH) được khuếch đại trong các phản ứng RT-qPCR đơn mồi (singleplex) với hỗn hợp Mix 1 bước. Hỗn hợp được sấy khô và bảo quản ở -20 °C (đường biểu diễn màu xanh) hoặc ủ ở 37 °C trong 12 tuần (đường màu tím). Hiệu suất của các phản ứng trước và sau khi sấy được hiển thị trong các biểu đồ nhỏ đi kèm. Sử dụng bốn nồng độ pha loãng nối tiếp của RNA chuột: 1,25 ng/μL, 125 pg/μL, 12,5 pg/μL, và 1,25 pg/μL. Điều kiện chu trình nhiệt: 45 °C trong 20 phút, 95 °C trong 2 phút, tiếp theo là 54 chu kỳ (95 °C trong 10 giây và 60 °C trong 30 giây).
Hình 2. So sánh đối thủ cạnh tranh trong việc phát hiện RNA đa mồi (fourplex) khi có và không có nước bọt người.
Bốn mục tiêu RNA (SARS-CoV-2 gene E, RSV, Influenza-A và Influenza-B) được khuếch đại khi có (hàng dưới) và không có (hàng trên) nước bọt người, trong các phản ứng RT-qPCR đa mồi 1 bước. Thí nghiệm so sánh giữa: Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix và Meridian Air-Dryable Direct RNA/DNA qPCR Saliva (sau khi sấy). Sử dụng bốn nồng độ pha loãng mẫu (4000, 400, 40 và 4 bản sao) với ba lần lặp lại kỹ thuật cho mỗi mục tiêu trong phản ứng 20 μL. Các phản ứng có nước bọt chứa 5 μL nước bọt pha loãng 1/10 trong môi trường vận chuyển đa năng (tương đương 2,5% nước bọt người trong mỗi phản ứng). Điều kiện nhiệt: 47 °C trong 10 phút, 95 °C trong 2 phút, tiếp theo là 50 chu kỳ (95 °C trong 10 giây và 60 °C trong 30 giây). Kết quả cho thấy sản phẩm tương đương với đối thủ khi không có nước bọt và vượt trội rõ rệt khi có mặt 2,5% nước bọt người.
Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe Mixes là gì?
Phản ứng PCR và qPCR có thể bị ức chế bởi nhiều loại hợp chất hóa học khác nhau. Các chất ức chế này ảnh hưởng tiêu cực đến quy trình làm việc và chẩn đoán. Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe Mixes là các hỗn hợp pha sẵn nồng độ 4x bao gồm: enzyme Taq DNA polymerase hot-start (cùng với enzyme phiên mã ngược RTase và chất ức chế RNase trong trường hợp mix 1 bước), các tác nhân đệm, magnesium, dNTPs và một hỗn hợp các tá dược để đảm bảo quá trình sấy khô tin cậy mà không làm mất hoạt tính enzyme, từ đó đảm bảo phản ứng qPCR dùng mẫu dò thành công trong định dạng một ống nghiệm.
Người dùng có thể kết hợp các hỗn hợp này với mồi, mẫu dò và mẫu khuôn (template) để phát hiện đơn mồi hoặc đa mồi. Các hỗn hợp này tương thích với tất cả các loại mẫu dò (TaqMan, Scorpions, molecular beacons) cũng như tương thích tối đa với tất cả các thiết bị Real-time PCR thương mại.
Ngoài ra, cả hai loại hỗn hợp đều có thể sấy khô (không chứa glycerol), do đó có thể sấy khô trong tủ sấy phòng thí nghiệm tiêu chuẩn để lưu trữ dài hạn ở nhiệt độ môi trường. Được thiết kế để sấy khô nhanh, các hỗn hợp này hướng tới việc phát triển các bộ kit chẩn đoán in vitro (IVD) hoặc cho bất kỳ ai muốn hưởng lợi từ phản ứng (RT-)qPCR dạng khô. Quy trình sấy khô bằng không khí yêu cầu ít thời gian và chuyên môn hơn đáng kể so với đông khô (lyophilisation) và chỉ cần thiết bị rất đơn giản. 5 μL hỗn hợp 4x (cần thiết cho thể tích phản ứng cuối 20 μL) có thể được sấy khô thành dạng gel bằng tủ sấy tiêu chuẩn chỉ trong 80-90 phút.
Hình 4. Hiệu suất của Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix trước và sau khi sấy.
Bốn mục tiêu RNA (SARS-CoV-2 gene E, RSV, Influenza-A và Influenza-B) được khuếch đại cùng với nước bọt người trong phản ứng RT-qPCR đa mồi 1 bước trước (đường màu xanh) và sau khi sấy (đường màu tím) (80 phút ở 40 °C). Điều kiện thí nghiệm tương tự như Hình 2 với 2,5% nước bọt người. Kết quả cho thấy hiệu suất của hỗn hợp không thay đổi sau quá trình sấy.
Các loại mẫu khuôn (template) phù hợp?
Hỗn hợp Probe Mix phù hợp để khuếch đại các mẫu DNA. Hỗn hợp 1-step Mix có thể dùng cho cả DNA và RNA mà không làm giảm hiệu suất, bất kể loại mẫu khuôn nào.
Các loại chất ức chế mà hỗn hợp có thể chịu đựng được
Cả hai loại hỗn hợp qPCR đã được kiểm chứng và có khả năng kháng lại dải rộng các chất ức chế PCR phổ biến, bao gồm nhưng không giới hạn ở:
Hóa chất phòng thí nghiệm: SDS, guanidine, và ethanol.
Chất ức chế từ mẫu sinh học: Máu (hemin, hematin, haemoglobin, heparin, IgG, lactoferrin, sodium citrate), nước bọt, nước tiểu (urea).
Mẫu thực vật và môi trường: Humic acid, catechin, quercetin, tannic acid, cellulose, và chlorophyl.
Lợi ích chính của việc sấy khô (Air-drying)
- Giảm thể tích và khối lượng: Giúp việc vận chuyển và lưu trữ rẻ hơn.
- Độ ổn định ở nhiệt độ phòng: Loại bỏ nhu cầu về chuỗi cung ứng lạnh (cold-chain), đơn giản hóa hậu cần và giảm chi phí tổng thể.
- Tăng thể tích mẫu đầu vào: Thể tích mẫu có thể bằng thể tích phản ứng cuối cùng. Điều này hoàn hảo cho các mẫu loãng có số lượng bản sao mục tiêu thấp.
- Dễ tiếp cận: Sấy bằng tủ sấy không yêu cầu thiết bị chuyên dụng hay kiến thức chuyên sâu, không cần thuê ngoài hay thêm nhân sự chuyên trách.
- Kiểm soát quy trình tốt hơn: Tăng khả năng kiểm soát quá trình sấy và phát triển sản phẩm cuối cho các đơn vị phát triển kit IVD quy mô vừa và nhỏ.
Ứng dụng
- qPCR và RT-qPCR chẩn đoán dựa trên mẫu dò (Probe-based).
- Phát hiện DNA & RNA.
- qPCR với mẫu dò TaqMan, Scorpions và Molecular Beacon.
- Thiết lập phản ứng đơn mồi (singleplex) và đa mồi (multiplex).
- qPCR & RT-qPCR trực tiếp từ nước bọt thô.
Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe Mix
| Component |
600 Reactions |
2000 Reactions |
10000 Reactions |
|
4x Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe Mix |
3 x 1 mL | 2 x 5 mL | 1 x 50 mL |
Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix
| Component |
600 Reactions |
2000 Reactions |
10000 Reactions |
| 4x Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix | 3 x 1 mL | 2 x 5 mL | 1 x 50 mL |
Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe Mix
| Reaction Volume | Storage |
| 20 μL | On arrival, products should be stored between -30 °C and -20 °C. If stored correctly the kit will retain full activity until the indicated expiry date. |
Instrument Compatibility
This product is compatible with all standard and fast cycling qPCR instruments that do not require passive reference dye. If passive reference is required, please contact our team for custom solutions.
Product Flyers
Product Manuals
PB90.41 Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe Mix Manual- PB90.51 Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix Manual
Material Safety Data Sheets
- PB90.41 Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe Mix MSDS
- PB90.51 Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe 1-Step Mix MSDS
Application Notes
- Application Note: Robust Clara® & Air-Dryable Inhibitor-Tolerant Probe Mixes tolerate a wide range of inhibitors
- Inhibitor-Tolerant Probe Mixes enable reliable target detection in crude saliva samples
- Developing Air-Dried, Inhibitor-Tolerant qPCR Assays: A simple fast and low-cost option for point-of-care diagnostics
Yes, results are still accurate even with reduced fluorescence. We have observed even 10-fold reduction in the fluorescence plateau when amplifying the same target in crude blood versus extracted samples. However, there is no inhibition of the mix up to the levels we have tested (6.25% crude blood:EDTA), this can be verified either by normalising fluorescence between crude blood and other samples, or by modifying the threshold used so that it is always the same percentage of the max fluorescence reached (e.g., 10%).
Reliable amplification for various targets has been achieved using 40 cycles with 1 s denaturation and 3 s annealing and extension (2-step cycling). Successful amplification under these conditions requires reasonably short amplicons and should be tested on case-by-case basis for all new targets added to an experiment.
Results will differ depending on the plant species and tissue type. Our inhibitor-tolerant chemistry shows moderate resistance to chlorophyll and polyphenols, such as catechin and quercetin, but low resistance to tannic acid, cellulose and pectin. Thus, testing the mix on the desired sample types is recommend. All plant tissues will require mechanical lysis in an appropriate extraction buffer to achieve disruption of cell walls and membranes, prior to use with inhibitor-tolerant mixes. We recommend testing a small number of reactions on the target sample type. Please reach out to our team info@pcrbio.com to request a product sample, or if you need assistance in planning such test reactions.
Yes, this is expected. Crude biological samples, particularly saliva, contain different levels of PCR inhibitors. We have observed a range of 0.5-3.5 cycles delay in amplification of the same target with different saliva samples. The same crude biological sample may also show different levels of inhibition over time.
Yes. While the mix is inhibitor-tolerant, it is not completely resistant to the presence of inhibitors. Different inhibitors and higher concentrations can still inhibit qPCR reactions. Given the sensitivity of the mix, if a significant delay is observed, we recommend diluting the sample before using in qPCR reactions.
Saliva samples do not require pre-treatment. However, dilution in appropriate sample transport medium is recommended. We highly recommend the use of UTM which don’t contain guanidinum chloride.
We have successfully tested up to 10% crude saliva per reaction, with best, most-consistent results when using 2.5% saliva
We have successfully carried out multiplex reactions on up to 5 μL of blood sample (1.25 μL of crude blood diluted 1:4 in a NaCl/EDTA solution) per 20 μL reaction. This does lead to a reduction in overall fluorescence but does not inhibit qPCR reactions themselves, nor does it limit the sensitivity of the mix.
All our inhibitor-tolerant mixes have been tested on and tolerate crude saliva and crude blood. Additionally, they have been extensively tested in the presence of multiple PCR inhibitors found in clinical, plant, environmental, and laboratory chemicals . These include: hemin, haemoglobin, heparin, lactoferrin, IgG immunoglobulins, guanidine, SDS, ethanol, urea, sodium citrate, humic acid, cellulose, pectin, quercetin, catechin, tannic acid, and chlorophyll B. The extent of tolerance varies by compound. The mixes may also be tolerant to other compounds, not listed, or not yet tested.
The drying conditions provided in the product manual are only an example of the tested cycles used in our labs. When air-drying, it is important to get a loss of weight (Loss on Drying, LoD), of approximately 70-75 %, which results in a dried gel containing only 5-10 % water.
Drying times may vary depending on the instrument used. When using this product for the first time with a specific oven, we recommend measuring the LoD using multiple tubes at regular times (e.g., after 60, 70, 80, 90 min) to define the best protocol and achieve a LoD of 74.5 ± 10.5 % or 70 ± 1 % based on the mix (with or without oligos) and the drying instrument used.
Temperatures can also be changed, but obviously lower temperatures will require longer times, while higher temperatures risk affecting the integrity of the mix components, so we recommend using 40 °C to minimise the chances of unexpected problems.
We do not recommend drying more than 5 – 6 μL of mix (plus oligos) per well following the instructions provided into the manual. Multiple plates can be dried at the same time for high throughput of manufacturing. We do not recommend air-drying larger volumes and recommend lyophilisation, using our Lyo-Ready range of products.
Although we successfully managed to lyophilise this mix, we do not recommend it be lyophilised. The excipient content has been optimised for air drying and this significantly reduces stability of the product lyophilisation. We recommend using this mix for air-drying only and recommend our Lyo-Ready product range for lyophilisation protocols.
Xem thêm