UltraScript® 2.0 Reverse Transcriptase & Kits

Việc chuyển phiên bản ngược RNA 20 kb có thể đạt được với tất cả các RTase của chúng tôi vì RTase có thể nhảy vào và ra khỏi các chất nền đã được gắn kết. Cấu trúc thứ cấp, liên kết không đặc hiệu và gắn kết sai có thể là những nguyên nhân phổ biến nhất dẫn đến việc phản ứng kết thúc sớm.

Chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng các mồi đặc hiệu hoặc oligo(dT) và tối ưu hóa từng khía cạnh của phản ứng, chẳng hạn như khác nhau nồng độ enzyme, mồi, nồng độ mồi, nhiệt độ và chu kỳ nhiệt độ cùng thời gian. Ngoài ra, bước PCR/qPCR tiếp theo có thể cần tối ưu hóa.

Chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng UltraScript® 2.0 RTase để chuyển phiên bản ngược các mẫu dài vì nó có thể duy trì nhiệt độ cao hơn trong thời gian dài, điều này có thể cần thiết khi xác suất của các cấu trúc thứ cấp trong RNA tăng theo chiều dài của nó.

Chúng tôi đã bao gồm tài liệu sau để bạn tham khảo¹.

1  Thiel, V. và cộng sự. Khuếch đại hiệu quả DNA dài 20-kb bằng phản ứng PCR chuyển phiên bản ngược. Anal Biochem 252, 62-70, doi:10.1006/abio.1997.2307 (1997).

Tất cả các RTase của chúng tôi đều có thể được sử dụng cho việc định lượng và phân tích miRNA. Tuy nhiên, chúng tôi không bán bất kỳ bộ kit chuyên dụng nào.

Chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng một trong hai phương pháp sau:

• Sử dụng mồi RT phổ quát và thêm đuôi poly(A) hoặc poly(U) (ví dụ, bằng poly(U)-polymerase), tiếp theo là tổng hợp cDNA sử dụng các mồi phổ quát^1,2.
• Sử dụng mồi RT đặc hiệu và bỏ qua bước thêm đuôi^1,3-5.

Nếu bạn không quen thuộc với các chi tiết cụ thể của những phương pháp này, vui lòng tham khảo danh sách tài liệu dưới đây, mà sẽ đóng vai trò hướng dẫn.

1  Dave, V. P. và cộng sự. Các công nghệ khuếch đại và phát hiện MicroRNA: cơ hội và thách thức cho các chẩn đoán điểm chăm sóc. Lab Invest 99, 452-469, doi:10.1038/s41374-018-0143-3 (2019).

2  Mei, Q. và cộng sự. Một phương pháp dễ dàng và cụ thể để định lượng microRNA bằng cách sử dụng phương pháp RT-qPCR tối ưu hóa. PLoS One 7, e46890, doi:10.1371/journal.pone.0046890 (2012).

3  Chen, C. và cộng sự. Định lượng thời gian thực của microRNA bằng RT-PCR vòng. Nucleic Acids Res 33, e179, doi:10.1093/nar/gni178 (2005).

4  Raymond, C. K., Roberts, B. S., Garrett-Engele, P., Lim, L. P. & Johnson, J. M. Phương pháp PCR đơn giản, định lượng để theo dõi trực tiếp microRNA và RNA can thiệp ngắn. RNA 11, 1737-1744, doi:10.1261/rna.2148705 (2005).

5  Androvic, P., Valihrach, L., Elling, J., Sjoback, R. & Kubista, M. RT-qPCR hai đuôi: một phương pháp mới cho việc định lượng miRNA chính xác cao. Nucleic Acids Res 45, e144, doi:10.1093/nar/gkx588 (2017).

UltraScript® 2.0 có khả năng xử lý các chất ức chế RT khác nhau, bao gồm cả những chất tồn tại trong máu và huyết tương. Chúng tôi khuyên bạn nên tối ưu hóa bằng cách thực hiện một phép kiểm tra lượng mẫu máu/huyết tương cho phản ứng RT, thay đổi lượng enzyme và pha loãng sản phẩm cDNA. Tham khảo “ Làm cách nào để giảm thiểu Ct cao trong bước qPCR hoặc sản phẩm PCR thấp trên gel sau bước RT (vấn đề PCR/qPCR)?” để điều chỉnh lại quy trình.

Tất cả các RTase của chúng tôi đều có thể được sử dụng trong ứng dụng chuyển mẫu. Hiện tại chúng tôi không cung cấp một quy trình hoàn chỉnh hay bộ kit chuyên dụng nhưng chúng tôi khuyên bạn nên tham khảo danh sách các bài viết này để lấy tài liệu tham khảo^1-4.

1  Takada, S. & Mano, H. Phân loại sự biểu hiện microRNA bằng mRAP. Nat Protoc 2, 3136-3145, doi:10.1038/nprot.2007.457 (2007).

2  Picelli, S. và cộng sự. RNA-seq toàn chiều dài từ các tế bào đơn bằng cách sử dụng Smart-seq2. Nat Protoc 9, 171-181, doi:10.1038/nprot.2014.006 (2014).

3  Moldovan, N. và cộng sự. Phương pháp giải trình tự đa nền tảng tiết lộ hồ sơ transcriptome mới trong virus Pseudorabies. Front Microbiol 8, 2708, doi:10.3389/fmicb.2017.02708 (2017).

4  Zajac, P., Islam, S., Hochgerner, H., Lonnerberg, P. & Linnarsson, S. Sở thích cơ sở trong việc kết hợp nuclêôtit không có mẫu thông qua các RTase phiên bản ngược xuất phát từ MMLV. PLoS One 8, e85270, doi:10.1371/journal.pone.0085270 (2013).

Thực hiện điện di gel để kiểm tra lượng sản phẩm cDNA. Nếu lượng sản phẩm cDNA sau bước RT không đủ, có thể có vấn đề với RTase làm ức chế Taq¹. Hãy thử giải quyết vấn đề này bằng cách pha loãng sản phẩm cDNA 10-20 lần trước khi thêm 2.5 μL của phản ứng pha loãng này vào 20 μL tổng thể tích phản ứng. Điều chỉnh cho phù hợp nếu các thể tích khác nhau. Ngoài ra, hãy thử pha loãng enzyme trước bước RT bằng cách thực hiện 5x, 10x, 20x và 40x pha loãng. Hai quy trình này cũng có thể được kết hợp nếu cần điều chỉnh thêm để tìm kết quả tối ưu.

1  Suslov, O. & Steindler, D. A. Sự ức chế PCR bởi phiên bản ngược transcriptase dẫn đến sự đánh giá sai về hiệu quả khuếch đại. Nucleic Acids Res 33, e181, doi:10.1093/nar/gni176 (2005).

Chúng tôi khuyên bạn trước tiên hãy đảm bảo rằng sản lượng cDNA thấp chứ không phải sản lượng PCR/qPCR hoặc Cts không đạt yêu cầu. Nếu trường hợp là thứ hai, hãy tham khảo “ Làm cách nào để giảm thiểu Ct cao trong bước qPCR hoặc sản phẩm PCR thấp trên gel sau bước RT (vấn đề PCR/qPCR)?”. Nếu trường hợp là thứ nhất, có thể có nhiều nguyên nhân cho việc sản lượng thấp xảy ra khi sử dụng UltraScript® 2.0:

• Khối lượng hoặc độ toàn vẹn của RNA của bạn có thể không đủ để đạt được một lượng sản phẩm đủ lớn cho bước endpoint hoặc qPCR tiếp theo. Hãy thử tăng lượng RNA và/hoặc kiểm tra chất lượng RNA của bạn bằng điện di gel và giá trị RIN. Cân nhắc sử dụng quy trình tinh chế thay thế cho RNA của bạn và/hoặc sử dụng chất ức chế RNase sớm. Tất cả các RTase của chúng tôi đều chứa chất ức chế RNase nhưng cho một số ứng dụng có thể cần thêm nó trước bước RT
• Các mẫu RNA của bạn có thể chứa các chất ức chế như hem, nồng độ cao NaCl, SDS, guanidine thiocyanate, melanin hoặc calcium¹. Hãy thử một phương pháp tinh chế thay thế loại bỏ tất cả các chất có thể ức chế phản ứng. Bạn cũng có thể thử pha loãng RNA của mình trước phản ứng. Điều này sẽ giảm sản lượng lý thuyết, nhưng cũng sẽ làm giảm các chất ức chế đến mức cho phép hơn để RTase hoạt động hiệu quả. Điều này vẫn có thể cung cấp đủ sản phẩm cho các bước tiếp theo.
• Một số RNA bản chất khó chuyển phiên bản do cấu trúc thứ cấp và/hoặc các đoạn chuỗi không phải là chất nền lý tưởng cho RTase. Hãy thử tăng nhiệt độ và/hoặc thực hiện quá trình biến tính RNA/gắn mồi, ở 70°C trong 10 phút, trước khi thêm RTase.
• Sử dụng điều trị RNAseH sau bước RT có thể làm tăng sản lượng, đặc biệt là cho các mục tiêu giàu GC vì các đôi RNA-DNA heteroduplex ổn định hơn so với các đôi DNA-DNA.
• Nếu các chuỗi của bạn vẫn bị thiếu, có thể cần sử dụng phương pháp tiếp cận cụ thể hơn với các mồi đặc hiệu hoặc chỉ oligo(dT). Chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng UltraScript® Reverse Transcriptase hoặc UltraScript® 2.0 Reverse Transcriptase đi kèm với một bộ đệm không có bất kỳ hexamer nào và oligo(dT)s cho mục đích đó.

1  Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L. & Johne, R. Chất ức chế PCR - sự xuất hiện, tính chất và loại bỏ. J Appl Microbiol 113, 1014-1026, doi:10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x (2012).

Cả hai sản phẩm đều được chiết xuất từ enzyme phiên bản ngược MMLV kiểu hoang dã và chứa nhiều đột biến tăng cường chức năng của chúng. Chúng đều là những RTase xuất sắc theo cách riêng của mình. UltraScript® 2.0 có độ ổn định nhiệt cao hơn lên đến 65°C và hơn thế nữa, kháng các chất ức chế và có khả năng chuyển phiên bản ngược số lượng lớn RNA lên tới 3.5 μg. UltraScript® 2.0 cũng có thể được sử dụng cho các ứng dụng yêu cầu độ nhạy do lượng RNA hiện có thấp, tuy nhiên, điều này yêu cầu tối ưu hóa đáng kể từ phía người sử dụng với công thức hiện tại và chúng tôi khuyên nên sử dụng UltraScript® thay thế. UltraScript® có thể được sử dụng với bộ kit 1 bước trong khi UltraScript® 2.0 chỉ nên được sử dụng như một phần của quy trình 2 bước (RT sau đó là PCR). UltraScript® 2.0 đặc biệt được khuyên dùng cho các mẫu dài và khó khăn chứa nhiều cấu trúc thứ cấp. Cả hai RTase đều có thể được sử dụng với bộ kit tổng hợp cDNA có/các hexamer và oligo-d(T).

• Pha loãng UltraScript® 2.0 trước khi phiên bản ngược.
  • Giả định rằng 2.5 µL phản ứng RT được chuyển sang 20 µL phản ứng PCR (pha loãng 4x)
  • Chúng tôi khuyên bạn nên pha loãng RTase 10x – 50x để loại bỏ hiệu ứng ức chế Taq do RTase gây ra.
  • Chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng bộ đệm sau đây hoặc tương đương cho các pha loãng:
  • 20 mM Tris/Cl pH 8.0 (25°C)
  • 100 mM KCl
  • 1 mM EDTA
  • 1 mM DTT
  • 5 % (w/v) Tween 20
  • 5% (w/v) Triton X-100
  • 50% (v/v)         Glycerol
• Pha loãng UltraScript® 2.0 sau khi phiên bản ngược, tức là, pha loãng hỗn hợp phản ứng
  • Pha loãng hỗn hợp phản ứng RT sẽ làm giảm hiệu ứng ức chế của RTase cũng như cDNA vì vậy chúng tôi khuyên bạn nên pha loãng từ 5x – 15x để tìm kiếm kết quả tối ưu.
  • Giả định rằng 2.5 µL phản ứng RT được chuyển sang 20 µL phản ứng PCR/qPCR, tỷ lệ pha loãng 4x cho tổng cộng 20x – 60x. Sử dụng nước để pha loãng phản ứng RT.

Nhìn chung, UltraScript® 2.0 có thể chuyển phiên bản ngược từ 20 pg đến 3.5 μg RNA. Hiệu suất phụ thuộc vào loại RNA, chất lượng RNA và xem liệu các mồi cụ thể, oligod(T)s hoặc hexamer ngẫu nhiên được sử dụng hay không. Nếu bạn đang làm việc với lượng RNA giữa 5 ng và 3.5 μg, tốt nhất là sử dụng UltraScript® 2.0 chưa pha loãng. Đối với các ứng dụng yêu cầu truy cập vào hiệu suất nhạy cảm hơn của UltraScript® 2.0, có thể cần phải pha loãng enzyme và sản phẩm cDNA. Vui lòng tham khảo “Làm cách nào để giảm thiểu Ct cao trong bước qPCR hoặc sản phẩm PCR thấp trên gel sau bước RT (vấn đề PCR/qPCR)?”. Hãy nhớ rằng khi sử dụng enzyme đã pha loãng hơn, hiệu suất ở lượng RNA nạp cao sẽ bị ảnh hưởng nhưng sẽ cải thiện độ nhạy vì hai yếu tố này bù trừ cho nhau.

Giống như hầu hết các RTase có sẵn trên thị trường, UltraScript® Reverse Transcriptase, cũng như tất cả các RTase khác mà chúng tôi cung cấp, được chiết xuất từ virus Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) kiểu hoang dã và có tỷ lệ sai sót là 1×10^-4 lỗi/bp¹. Điều này cũng áp dụng cho các RTase có nguồn gốc từ Avian Myeloblastosis Virus (AMV).

Chạy phản ứng ở nhiệt độ cao hơn tăng độ chính xác vì nó làm mất ổn định các cặp cơ sở không khớp². Nếu yêu cầu độ chính xác thấp, việc thêm mangan sẽ làm cho RTase trở nên rất đột biến và có thể tăng tốc độ của chúng³.

1  Yasukawa, K. và cộng sự. Phân tích độ chính xác của phiên bản ngược transcriptase dựa trên công nghệ giải trình tự thế hệ tiếp theo. Biochem Biophys Res Commun 492, 147-153, doi:10.1016/j.bbrc.2017.07.169 (2017).

2  Malboeuf, C. M., Isaacs, S. J., Tran, N. H. & Kim, B. Những ảnh hưởng nhiệt độ đối với phiên bản ngược: cải thiện độ chính xác và tính chính xác trong tổng hợp cDNA. Biotechniques 30, 1074-1078, 1080, 1082, passim, doi:10.2144/01305rr06 (2001).

3  Cadwell, R. C. & Joyce, G. F. Sự ngẫu nhiên của các gen thông qua đột biến PCR. PCR Methods Appl 2, 28-33 (1992).

Có thể có nhiều lý do cho việc xuất hiện những vết mờ hoặc sản phẩm không đặc hiệu sau phản ứng RT. Các điểm sau có thể được xem xét để khắc phục:

• Điều quan trọng là phải xác định xem vấn đề có liên quan đến bước phiên bản ngược hay bước PCR/qPCR, miễn là bước PCR/qPCR được thực hiện ngay sau bước phiên bản ngược. Sử dụng các kiểm soát thích hợp và khắc phục vấn đề trong phản ứng PCR/qPCR để loại trừ điều này ra khỏi danh sách những bước tiềm năng gây ra các vấn đề trên.
• Vết mờ có thể chỉ ra sự oligomer hóa của mồi. Oligomer hóa có thể xảy ra nếu mồi thiết kế không tốt và nồng độ mẫu thấp. Điều này sẽ dẫn đến việc phiên bản ngược của các mồi-dimer hoặc chuỗi ngoài mục tiêu. Chúng tôi khuyên bạn nên thiết kế lại các mồi, tăng nhiệt độ phản ứng, tăng lượng mẫu, giảm nồng độ mồi hoặc rút ngắn thời gian phản ứng. Những yếu tố này cũng có thể áp dụng cho các băng không đặc hiệu.
• Có thể mồi không đặc hiệu với chuỗi mục tiêu của bạn và có thể cần thiết phải thiết kế lại.
• Các mồi chống lại các chuỗi lặp lại cao có thể gây ra hiện tượng vết mờ và có thể cần phải cân nhắc việc thiết kế lại các mồi.
• RNA của bạn có thể đã bị phân hủy. Hãy thử tăng lượng RNA và/hoặc kiểm tra chất lượng RNA của bạn bằng điện di gel và giá trị RIN. Thử một quy trình tinh chế thay thế cho RNA của bạn và/hoặc sử dụng chất ức chế RNase sớm. Tất cả các RTase của chúng tôi đều chứa chất ức chế RNA nhưng cho một số ứng dụng, có thể cần thêm nó trước bước RT.
• Cân nhắc các biện pháp phòng ngừa tiêu chuẩn khi xử lý RNA chẳng hạn như sử dụng găng tay, pipet với rào chắn aerosol, v.v.
• Đảm bảo không có nhiễm DNA.